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    植物膜蛋白提取試劑盒
    描述:植物膜蛋白占植物細胞總蛋白的很小一部分,但是在植物生理學中起著非常重要的作用。傳統的植物膜蛋白分離純化方法是蔗糖密度梯度離心法和雙液相法。這些方法雖然比較有效,但是需要超高速離心和大量的起始原材料,操作過十分繁瑣和費時。
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    描述:植物膜蛋白占植物細胞總蛋白的很小一部分,但是在植物生理學中起著非常重要的作用。傳統的植物膜蛋白分離純化方法是蔗糖密度梯度離心法和雙液相法。這些方法雖然比較有效,但是需要超高速離心和大量的起始原材料,操作過十分繁瑣和費時。為了克服植物膜蛋白提取中的缺點,我們特別開發了此款植物膜蛋白提取試劑盒。植物組織首先通過緩沖液 A 中致敏,勻漿,然后通過一個特殊的離心管柱,在此過程中勻漿的組織通過柱子特有的 Z 字形通路后細胞膜被切割成大小相等的碎片,后續無需超高速離心,通過差速離心法和密度梯度離心法將天然的質膜蛋白從未破裂的細胞,細胞核,細胞質和細胞器的混合物中分離出來。在每次實驗中僅需使用相同量的起始材料,離心力和離心時間,即可高度富集膜蛋白,并保證一致性良好。整個操作過程大約 1 小時可以完成。

    應用:試劑盒用于快速從植物組織中分離天然膜蛋白,可應用于 SDS-PAGE,immunoblottings,ELISA,IP,膜蛋白質結構分析,2-D,酶活性測定及其他應用。
    儲存條件:-20℃儲存


    應用:

    試劑盒用于快速從植物組織中分離天然膜蛋白,可應用于 SDS-PAGE,immunoblottings,ELISA,IP,膜蛋白質

    結構分析,2-D,酶活性測定及其他應用。

    試劑盒組份(50 次):

    1. 25 ml 裂解液 A

    2. 10 ml 裂解液 B

    3. 50 個離心管柱

    4. 50 個收集管

    5.4 根塑料研磨棒

    6. 組織分離粉

    儲存:

    -20℃儲存

    所需附加材料

    1XPBS

    渦旋震蕩儀

    臺式離心機

    說明書中 rpm 根據 Eppendoff 5415C 臺式離心機換算

    重要產品信息

    1. 仔細閱讀整個操作說明。將緩沖液 A 和緩沖液 B 完全解凍后搖勻,放置于冰上。將離心管柱和接收管套管

    放置于冰上預冷。

    2. 所有離心步驟都需要在 4℃室溫下或者低溫離心機中進行。

    3. 研究蛋白磷酸化,磷酸酶抑制劑應在使用前加入緩沖液 A 中。蛋白酶抑制劑可以選擇添加或不添加。

    4. 推薦使用 BCA 試劑盒用于蛋白濃度測定

    膜蛋白分離步驟

    組織勻漿:由于植物樣品的多樣性,選擇最佳的勻漿方法是得到最佳結果

    的關鍵。

    1. 將離心管柱及接收管套管放置冰上預冷

    2. A. 大 部 分 較 軟 的 植 物 組 織 樣 品 , 將 新 鮮 組 織 或 冷 凍 組 織 ( 200-300mg ) 切成小片

    (1-2mmX1-2mm),放入離心管柱套管上,用 1ml 吸頭反復擠壓組織減少體積,稱取 50-80mg

    組織分離粉加入離心管柱中,用塑料棒反復扭轉研磨組織 1-2 分鐘。加入 100ul Buffer A 至離

    心管柱中,然后繼續研磨幾分鐘,加 A 至滿為止,開蓋冰上孵育 5 分鐘。接轉步驟 3。

    B.含水量較多的組織樣品(例如水果組織),將大約 300mg 組織樣品剪切成小塊放入離心管柱

    中,臺式離心機最高速離心 1 分鐘去除多余水分,然后按照上一條描述方法勻漿,勻漿后冰上

    孵育 5 分鐘,接轉步驟 3。

    C.較難研磨的組織樣品(例如根和水稻葉片),勻漿步驟可在離心管柱外用研缽或同類勻漿

    設備進行操作。勻漿后,加入適量的 Buffer A(大約 300-400ul),冰上孵育 5 分鐘,將勻漿好

    的樣品轉移到離心管柱中,然后接轉步驟 3。

    3. 蓋上蓋子,14000rpm(16,000Xg)離心 30 秒。(需要最短時間達到設定轉速)

    4. 棄去離心管柱,渦旋大力震蕩 10-20 秒重懸沉淀。

    以下步驟將植物組織勻漿分為四個組分:細胞核、細胞質、細胞器和質膜。

    5. 3000rpm(700Xg)離心 1 分鐘(沉淀包括完整的細胞核和大的碎片)。

    6. 將上清轉移到新的 1.5ml 離心管中,4℃,16000Xg 離心 30 分鐘(延長離心時間可以增加產

    量)。棄去上清(上清為胞漿組份),保存沉淀(沉淀為總膜蛋白組份包括細胞器和質膜)。如果不

    需要分離質膜做到此步驟即可,將總膜組份存儲于-80℃。如果需要分離質膜,請不要冷凍總膜組

    份,繼續第 7 步驟。

    7. 加入 200ul Buffer B 用吸頭反復吹打或渦旋震蕩重懸第 6 步的總膜蛋白組份。4℃,10000rpm

    (7800Xg)離心 5 分鐘(注意:如果最終質膜組份中含有細胞器膜污染,此步驟離心時間可增加

    到 20 分鐘提高純度)。沉淀部分為細胞器.

    8.第 7 步離心后,小心的將上清液轉移到新的 2.0ml 離心管中,加入 1.6ml 預冷的 PBS,蓋上蓋子

    混勻幾次。14000rpm(16000Xg)離心 30 分鐘(延長離心時間可以增加產量)。棄去上清液,保

    存沉淀(沉淀為質膜蛋白)。產量一般為 10-100ug。質膜蛋白可以根據下游實驗需求用 20-200ul

    含表面活劑的緩沖液溶解,例如含有 Triton X-100,NP-40 或者 SDS 的 PBS 溶液。

    關于分離出的質膜蛋白評價

    許多研究人員利用 WB 對分離的膜蛋白進行純度檢測。一些常用的“胞漿內參”不僅僅存在于胞漿。例如 actin(1), 

    GAPDH (2) 和 tubulin (3)主要存在于胞漿但是他們也存在于質膜中。所以在某些細胞和組織膜蛋白中可以檢測

    到這些內參的弱信號不足為奇。更多相關信息,請參閱以下出版物:

    (1). Gruenstein E., et al. (1975). Actin associated with membranes from 3T3 mouse fibroblast and Hela cells. Journal of 

    cell Biology. 64:223-234. 

    (2). Terrasse R., et al. (2012). Human and pneumococcal cell surface glyceraldehydes -3-phosphate dehydrogenase 

    (GAPDH) proteins are both ligands of human C1q protein. J. Biol. Chem. 287:42620-42633.

    (3). Wolff J. (2009). Plasma membrane tubulin. Biochemica et BiophysicaActa

    常見問題

    問題                                       解決方案

    1、低蛋白產量                    

    增加起始細胞/組織的數量

    增加第二步孵育時間到 10 分鐘


    2、低蛋白活性 

    保證裂解物低溫/添加蛋白酶抑制劑


    3、離心 30 秒后離心管柱中還存留細胞裂解物 

    減少起始細胞/組織的數量或增加離心時間到 2 分鐘


    4、質膜蛋白中有胞漿蛋白污染 

    用 0.5ml 預冷的 PBS(含 0.3MNacl,PH9.5)清洗質膜沉淀