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新生DNA的追蹤者—BrdU

發布日期:2016-02-15 15:55:22 【關閉】
摘要:Brdu抗體實驗

福建快三中奖规则和奖金分配 www.snxea.com 說到標記,大家一定不會忘記老一輩科學家做研究時動不動就借助同(bu)位(pa)素(si), 不管是動植物的營養代謝,微生物的感染增殖,還是蛋白質等大分子的表達與調控,都離不開同位素的幫助。直到后來有了酶和熒光的普及后,同位素才逐漸退出歷史舞臺。

今天向您介紹的這種物質,在生命科學研究中的標記應用中也扮演著十分重要的角色。 先來看看,它長這樣:20160215153350

它就叫BrdU,中文名字叫5-溴脫氧尿嘧啶核苷, English Name5-Bromo-2-deoxyuridine,這貨是不是看起來有點眼熟?沒錯,它和下面這位兄弟長得十分神似:

2016001

沒錯,這就是胸腺嘧啶核苷(胸苷), DNA的主要零件之一。BrdU和胸苷的結構是如此之像,以至于在養細胞時添加BrdU,或往動物體內注射BrdU時,細胞會傻傻地把它當胸苷利用,而摻入到新合成的DNA鏈中,當用抗BrdU的抗體檢測時,就可以標記出新合成的DNA或反映出產生的細胞來。

根據這一特性,大家把BrdU標記方法發揮得淋漓盡致。稍舉幾個例子:研究個體發育時,使用BrdU就可以清晰地追蹤出每一天新長出的細胞有哪些; 研究干細胞分化時,利用BrdU外加細胞marker,就可以分析出干細胞的分化狀況;研究腫瘤侵襲與轉移模型時,利用BrdU可以分析出其轉移或侵襲的路徑;利用BrdU還可以分析創傷的修復或組織的重建情況……

2016002

 

 

聽起來有些小激動不是? 那么問題來了,這些聽上去高上大的實驗都是怎么進行的呢?這里就拋磚引玉簡單介紹一下最常用的免疫組織化學和免疫熒光步驟。

免疫組化以觀察小鼠脾臟細胞增殖為例:

1)第一日向小鼠腹腔或皮下注射BrdU溶液,按50mg/kg劑量注射。(悄悄告訴你,一只6-8周大的Balb/C小鼠大約20-25g重)。 第二日重復一次,第三日放血處死小鼠,取出脾臟。

2)按照IHC的流程固定取下的脾臟,包埋、切片、脫蠟……(此處省略1000字)。

3)將脫蠟水化的片子用純水洗滌2-3次, 放入2M HCl中浸泡30min 37度)。這一步非常非常重要,因為BrdU摻入到DNA后無法曝露,HCl浸泡可以使DNA解離,從而使BrdU充份暴露出來。尤其要注意的是,實驗室用的濃鹽酸因為揮發,濃度可能遠遠低于標稱的濃度,所以在使用前需要重新標定濃度。這里提供一個懶人的方法:將濃HCl稀釋上百或上千倍后,用pH計測定pH,再通過測得的pH就可以反算出原始的濃度來(不會算的童鞋,趕緊去請教初中化學老師吧,我只能幫您到這兒了)。

4)用足量PBS沖洗切片中和掉殘留的HCl,再將其用3%過氧化氫于37度浸泡半小時而破壞內源性過氧化物酶,防止后續產生背景。然后再用BSA封閉。

5)加入抗BrdU的一抗(稀釋度參考一抗說明書)。

6)洗滌一抗后加入二抗。

7)洗滌顯色,大功告成!

Show一張Proteintech的結果(左邊是BrdU處理的,右邊是正常脾臟),顯棕色信號的細胞就是打BrdU之后新長的啦:

brdu3

 

接下來再看看免疫熒光,以觀察HeLa細胞增殖為例:

1)按正常的IF步驟養好細胞,爬片。

2)向培養基里添加BrdU0.03mg/ml左右,替換掉原來的培養基繼續培養2小時左右。如果細胞密度不大或想看到更多的細胞可以延長培養時間。

3)用PBS沖洗掉片子上的培養基,乙醇或10%多聚甲醛固定。固定結束后,PBS沖洗之,再放于2M HCl中浸泡30min 37度),這一步與上面免疫組化完全相同,同樣地,實驗用的HCl需要重新標定。

4)用足量的PBS中和掉殘留的HCl,再BSA封閉。

5)上一抗,二抗,熒光顯微鏡下觀察……此處再省略1000。

還是Proteintech的結果:

brdu4

 

怎么樣?看了兩個例子,想必您一定融會貫通,玩BrdU于掌股之間了吧。


最后,強烈推薦Proteintech BrdU單抗(貨號:66241-1-Ig!

 

 

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本文來自Proteintech微信公眾號。